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前言：色譜柱是HPLC系統(tǒng)的心臟。色譜柱的技術(shù)從HPLC流行以來有了很大的進步，分離速度和性能有了提高，同時穩(wěn)定性和重現(xiàn)性也提高很明顯。下面以反相色譜柱為例，介紹一些色譜柱基本知識。

一、色譜柱填料

下圖為色譜柱的組成

1、色譜柱載體

大多數(shù)用于HPLC分離的柱填料使用硅膠微粒作為擔體，也有基于多孔聚合物擔體的色譜柱。

下圖所示為HPLC中常見的幾種微粒類型：

全多孔微球因其粒徑、孔徑和表面積變化較大，一般情況下效能、荷載量、耐久性等都較好，為我們常用。

硅膠填充微粒

硅膠微粒是我們常用的，優(yōu)點是它們的機械強度高，可保證填充床長時間在很高的操作壓力下工作，柱效保持穩(wěn)定。在用于制作HPLC填料的材料中，硅膠基質(zhì)色譜柱的柱效*高。

另一個優(yōu)勢就是他們可以和不同的配合基鍵合（C8、C18、苯基和氰基等）。

用于HPLC的硅膠表層都是羥基化的，稱為水合硅膠（-SiOH），水合硅膠分為三種存在類型，如下圖：

含有自由硅羥基的硅膠因為只有部分羥基化，酸性很強，能與堿性溶質(zhì)產(chǎn)生強烈的無益結(jié)合，因此，含自由、酸性硅羥基濃度高的硅膠基質(zhì)會使堿性樣品保留值增加，峰變寬、拖尾。見下圖。

有些色譜柱經(jīng)過封端后能夠降低自由硅羥基，減少對堿性樣品的影響。見下圖2.色譜柱固定相

2.1.鍵合固定相

硅膠基質(zhì)的反相填料一般通過在擔體表面上共價鍵合有機硅烷或沉積聚合物有機涂層。 

2.2、鍵合固定相的形式：許多鍵合相填料都是用單官能團試劑制得，也有些商品填料是用三官能團(有時也用雙官能團)硅烷與硅膠表面反應形成的交聯(lián)聚合表層。見下圖。

3、鍵合的類型

圖所示為填料與官能團共價鍵合的各種類型。圖a所示為用雙或三官能團硅烷反應的輕度縱向交聯(lián)相，由這些反應得到的鍵合相，在低pH時，比單體相的非交聯(lián)固定相更穩(wěn)定，但與用單官能鍵合相比較，用此方式制得的填料柱間的保留值與選擇性不太穩(wěn)定。圖b所示為另一類型的鍵合硅烷的表面，稱作橫向交聯(lián)，這些填料在低pH與高pH環(huán)境中均非常穩(wěn)定。如圖c和d所示，是非交聯(lián)型的柱填料，通常通過單官能團二甲基氯硅烷與表面硅經(jīng)基反應得到，存在二甲基取代及位阻保護結(jié)構(gòu)兩種，如：正一十八烷基硅烷ODS或C₁₈鍵合相材料，單官能團硅烷反應的優(yōu)點是重現(xiàn)性好，一個硅烷基與一個硅烷分子反應，產(chǎn)生可預測的結(jié)構(gòu)，而且制得的填料柱效較高，因為溶質(zhì)分子在薄固定相層內(nèi)的擴散迅速。

一般情況下，由于鍵合相配位體的空間位阻效應，硅膠基質(zhì)表面的硅羥基不能*參加反應，隨著鏈長或硅烷體積的增大，參加反應的硅經(jīng)基比例相應減小，這些未反應的硅羥基能在分離離子樣品，特別是堿性樣品的時候通過離子交換作用導致保留值增加，譜峰拖尾，柱間重復性差。

二、色譜柱各個參數(shù)意義

孔徑是粒徑是硅膠球的直徑，孔徑是指硅膠球上小孔的直徑。但這個小孔是不穿過球體的，只是球上凹進去的一塊。可以簡單想成高爾夫球的樣子。樣品分子進入這個小孔，在小孔內(nèi)被鍵合的烷基吸附，然后出來有快有慢，達到分離的目的。

孔徑小，含孔率高，則比表面積大，載碳量高„ 化合物在孔內(nèi)分離„ 孔徑大小必須和分子大小相匹配，分子必須能進入孔內(nèi)，一般小分子使用80-120A， 大分子通常使用300A。為了達到最佳分離,一般要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上。